从FFPE组织样本中高效纯化基因组DNA，适合用于NGS分析

Features

采用优化的裂解液，可从FFPE样品中高效回收gDNA

酶促反应去除胞嘧啶脱氨产物

最大限度减少假阳性SNP检出风险

在DNA测序应用中获得出色结果

可在QIAcube全自动核酸纯化仪上自动运行

Product Details

GeneRead DNA FFPE Kit采用基于硅胶模离心柱的优化实验方案，能够从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本中纯化出高品质基因组DNA。由于胞嘧啶的脱氨作用所导致的C>T人为突变现象在二代测序技术中影响很大。此类人为突变由福尔马林固定以及样本老化所引发，会导致测序结果产生偏差。GeneRead FFPE纯化步骤中引入了酶促处理，能够消除此类人为突变，从而保证了基因组DNA的产量高、纯度好，特别适用于二代测序应用。

Performance

从有限的起始材料中获得高产率

由于文库制备和测序技术的不断进步，对生物样本库内大量的FFPE组织样本实施高通量测序逐渐成为可能，这无疑吸引了研究者的目光。这些测序技术同时也降低了可靠检测测序突变的频度阈值。不过，对FFPE样本进行测序还是存在多种挑战。FFPE样本的DNA产率可能受到DNA损伤的影响。此外，这些样本通常具有不可替代性，因此需要从最少量的起始材料中获取最多的核酸样本量。除了DNA产率的考虑之外，人为突变对FFPE样本测序的影响在起始样本量有限的情况下也会变得更为严重，此时错误突变的频率也会相应增加。相比标准的FFPE DNA分离方案，GeneRead DNA FFPE Kit能够为小样本（1 x 10 μm切片样本）提供更高产量的双链DNA。GeneRead DNA FFPE Kit与另一供应商的同类试剂盒相比，可获得高达4倍的双链DNA产率。

有效减少人为的C>T|G>A转换

由福尔马林固定和储存所致的DNA损伤主要以随机形式发生，因此序列上的突变位置不同。只有少数基因组拷贝上发生了全局性的破坏，因此这些人为突变的发生频率通常较低。而低频度的新突变可能携带有十分重要的信息（例如在癌症分析中），因此很有必要在低频突变中区分真实突变与人为突变。GeneRead DNA FFPE方案通过考查样本的新低频突变，可对人为突变的数目以及清除效率进行测定。GeneRead DNA FFPE Kit极大降低了低频C>T|G>A转换，同时有效保留了真实突变。

最大限度减少假阳性突变的风险

在癌症相关的SNP分析过程中，去除C>T|G>A的人为突变显得尤为重要。脱氨作用多为随机发生，如这些人为突变未经有效清除，可能被解释为具有癌症相关性的突变，进而成为假阳性结果。GeneRead DNA FFPE Kit去除人为突变，从而使假阳性风险降至最低。

Principle

从FFPE组织为二代测序制备DNA还有几个挑战。由于样品稀缺和DNA可能存在受损状况，DNA产量通常较为有限。此外，从有限材料开始的测序过程，往往存在由于固定和包埋条件以及长期储存而产生的人为突变。这之中的一个特殊问题是，胞嘧啶碱基脱氨变成脱氧尿嘧啶，从而导致在测序反应中出现C-T转变。此现象的确切机制尚未可知，可能的解释是胞嘧啶的脱氨作用导致在该位置产生了尿嘧啶，后者会与腺嘌呤配对。在测序过程中，这一改变随后会按照C>T转换后的结果读取。如果在文库构建过程中链信息未能保留，则两条链都会被测序，这时此人为突变可能显示为C>T或G>A转换。很有必要去除这些人为突变，特别是对于癌症样本的测序分析而言，因为这些干扰在此类样本中会被检测为假阳性。当进行FFPE样本测序时，由于起始原料有限而假阳性基因突变的相对频率增加，避免人为突变至关重要。

GeneRead DNA FFPE Kit提供了一种从少量FFPE组织切片高效纯化高产率DNA的高效流程。此外，该流程包含去除脱氨基胞嘧啶的步骤，可避免DNA测序出现假阳性结果。

Procedure

在结合QIAamp MinElute柱之前进行脱蜡并对DNA样品的甲醛解交联。加热除去交联后，DNA就可以通过尿嘧啶DNA糖苷酶特异地去除脱氨基胞嘧啶残基。优化的反应混合物提供了适宜的反应条件，使UNG能从FFPE样品的DNA中特异性去除人为导致的尿嘧啶。DNA结合到离心柱之后，经由Buffer AW1、Buffer AW2和乙醇洗去残留的杂质（比如盐）。残留的乙醇可能干扰随后的酶促反应，需另外由离心步骤彻底去除。DNA洗脱后可直接用于二代测序，也可在–20℃下储存。

GeneRead FFPE DNA kit也可在QIAcube全自动核酸纯化仪上自动运行。

Applications

GeneRead DNA FFPE Kit可有效减少胞嘧啶脱氨人为突变，从FFPE样品中纯化出可直接供二代测序使用的DNA。

Supporting data and figures

High yields of double-stranded DNA.

Single 10 μm slices of FFPE tissue were used to compare the results of DNA purification using standard and GeneRead protocols for FFPE samples. The wide range of DNA yields seen is due to the variation in the starting material. This is common for DNA purification from FFPE samples.