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8-OHdG检测样品预处理程序(组织/细胞培养)-JaICA
2020-07-08 154 分享到:

Detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in tissue/cultured cells.

JaICA高灵敏度8-OHdG Check ELISA试剂盒适用样品包括组织,细胞培养,血清/血浆,尿液,本文介绍8-OHdG检测前的组织/细胞培养样品预处理程序(点击这里查看8-OHdG检测血清/血浆样品预处理程序)。

这是检测组织样品或培养细胞中的8-OHdG的应用示例。实验条件应由每个用户确定。

1. 从细胞中提取DNA

使用DNA提取试剂盒从匀浆中提取DNA。请遵照产品说明书操作。


以下是适用于8-OHdG检测的DNA提取试剂盒,可从WAKO Chemicals USA Inc.和WAKO Chemicals GmbH(德国)获得。

1)DNA提取® WB试剂盒(碘化钠的方法):目录号291-50502

2)DNA提取® TIS试剂盒(碘化钠的方法):目录号296-67701

3)的8-OHdG检测制剂试剂组:目录号292- 67801

2. DNA浓度和纯度的计算

   a) 用TE缓冲液将DNA溶液稀释至20-50 µg / mL。

   b) 在230nm,260nm,280nm和320nm波长处测量吸光度。

   C) 计算DNA浓度。(260nm处的吸光度1.0等于50 µg / mL DNA)

DNA浓度(µg / mL)=(260nm处的吸光度)*(50 µg / mL)*稀释率

   d) 检查DNA样品的纯度。

(260nm处的吸光度):(280nm处的吸光度)之比通常在1.8至1.85之间。

分离的DNA的纯度通过(在260nm处的吸光度)与(在230nm处的吸光度)之比评估,并且应在2.2至2.25之间。

3. DNA的酶消化

   a) 将200 µg提取的DNA溶解在135 µL的水中。

   b) 向DNA溶液中加入15微升200mM乙酸钠和6单位核酸酶P1(15 µL,1 mg / mL),然后在氩气置换后于37°C孵育30分钟至1小时。

   C) 加入1M Tris-HCl缓冲液(15 µL,pH 7.4)和2单位碱性磷酸酶(7 µL,200单位/0.7mL),在氩气置换后于37°C孵育30分钟至1小时。

   d) 为了除去酶和其他大分子,将水解产物通过Millipore Microcon YM-10(catalog#42407)在14000rpm下过滤10分钟。

   e) 将50 µL DNA消化液加到ELISA试剂盒的孔中。建议应在一天之内完成此处提到的分析程序。

 注意:

1)经酶处理的样品应在同一天使用。

2)TE缓冲液:1mM EDTA / 10mM Tris-HCl,pH8.0

3)所用的水应通过Chelex(Bio Rad)处理以去除痕量金属离子。


参考文献

1) ML Hamilton,Z Guo,CD Fuller,H Van Remmen,WF Ward,SN Austad,DA Troyer,I Thompson,A Richardson:

使用碘化钠方法可靠地评估核和线粒体DNA中的8-oxo-2-deoxyguanosine水平分离DNA。

核酸研究。Vol.29(10),p2117-2126,2001

2) S丰国等。等:

单克隆抗体N45.1定量免疫组织化学测定8-羟基-2'-脱氧鸟苷:在次氮基三乙酸铁诱导的肾癌模型中的应用。

实验室调查,第一卷。76,No.3,p365-374,1997年

3) M Kakimoto,T Inoguchi,T Sonta,HY Yu,M Imamura,T Etoh,T Hashimoto和H Nawata:

糖尿病大鼠肾脏中8-羟基-2'-脱氧鸟苷的积累和线粒体DNA缺失。

糖尿病卷 51,p1588-1595,2002

4) D Nakae,Y Mizumoto,E Kobayashi,O Noguchi和Y Konishi:

改进的基因组/核DNA提取技术可用于少量大鼠肝组织的8-羟基脱氧鸟苷分析。

癌症通讯。97,p233-239,1995