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Cal-590™, potassium salt
货号:20519 | 规格:1 mg | 价格:¥0.00 | 品牌:AAT Bioquest
Cal-590™, potassium salt是由北京中昊新生科技有限公司提供,美国AAT Bioquest公司是生物光谱领域全球领导者,为生命科学研究、诊断R&D及药物开发领域提供生物分析研究试剂和试剂盒。
钙的测量对于许多生物学研究至关重要。荧光探针显示结合钙的光谱响应,使研究人员能够通过荧光显微镜,流式细胞仪,荧光光谱和荧光酶标仪研究细胞内游离钙浓度的变化。 Rhod-2最常用于红色荧光钙指示剂中。然而,Rhod-2 AM在酯酶水解后仅在活细胞中发生中度荧光,并且具有非常小的细胞钙响应。 Cal-590 已被开发用于改善Rhod-2细胞负载和钙响应,同时保持Rhod-2的光谱波长,使其与TRITC /Cy3®过滤片组兼容。在CHO和HEK细胞中,Cal-590 AM具有比Rhod-2 AM更敏感的细胞钙响应。 Cal-590的光谱与FITC,AlexaFluor®488和GFP的光谱完全分离,使其成为用GFP细胞系或FITC / AlexaFluor®488标记抗体复合细胞内检测的理想钙探针。

使用Cal-520 AM,Cal-570 AM或Cal-630 AM酯类

1.使用Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 AM酯:

AM酯是非极性酯,其易于穿过活细胞膜,并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是,使用AM酯时必须小心,因为它们易于水解,特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜(DMSO)。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下,AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南,实际应根据您的具体需求进行修改。

a)在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b)在实验当天,将Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液(HHBS)或您选择的缓冲液(0.04%Pluronic®F-127)中制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意:非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c)如果您的细胞(如CHO细胞)含有有机阴离子转运蛋白,可将丙磺舒(1-2 mM)加入染料工作溶液中(最终浓度为0.5-1 mM)以减少渗漏去酯化指标。

d)将等体积的染料工作溶液(来自步骤b或c)加入细胞板中。

e)将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟,然后在室温下将板孵育另外30分钟。

注意:孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f)用HHBS或您选择的缓冲液(含有阴离子转运蛋白抑制剂,如1mM丙磺舒,如果适用)替换染料工作溶液,以去除多余的探针。

g)在Ex / Em = 490 / 525nm(对于Cal-520 AM),540 / 5000nm(对于Cal-590 AM)或600 / 640nm(对于Cal-630 AM)进行实验。



2.测量细胞内钙响应:

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd,使用以下等式:

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光,Fmin是不存在钙时的荧光,Fmax是钙饱和探针的荧光。

解离常数(Kd)是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比,荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca2+缓冲液来进行原位校准。 或者,细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2+水平。
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