猪甲状腺素ELISA试剂盒

猪Thyroxine ELISA试剂盒用于定量检测猪血清, 血浆, 细胞培养上清和组织样品中的Thyroxine浓度。该检测可识别重组和天然的猪Thyroxine。

检测方法:Sandwich ELISA(Quantitative)
样本类型:Serum, plasma, Cell culture supernatant and tissue samples
反应物种:Porcine
检测目标:Thyroxine
样本量:50-100 µl
读数:450 nm
特异性:
The assay will recognize both natural and recombinant Porcine Thyroxine.
经检测与其它相似物质无明显交叉反应.
批内差:CV<8%
批间差:CV<10%
回收率:85-110%
储存条件:2-8℃,6个月。
別名:
Thyroxine; T4; 3,5,3',5'-Tetraiodothyronine; L-Thyroxine; Levothyroxine

检测原理:
BMASSAY®猪Thyroxine ELISA试剂盒基于双抗体夹心ELISA(Sandwich ELISA)酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)。抗猪Thyroxine单克隆抗体已预包被在酶标板上，样品和生物素化抗体先后加入酶标板孔反应后，经PBS或TBS洗涤，随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应，经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。

试剂盒组分:
预包被96孔板(12 x 8 well strips)
标准品
浓缩生物素化抗体
浓缩酶结合物(ABC)
酶结合物(ABC)稀释液
抗体稀释液
标准品稀释液
样品稀释液
浓缩洗涤液(25×)
显色剂A
显色剂B
终止液

需自备物品：
1. 酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片) ；
2. 洗板机；
3. 高精度移液器（量程为0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl)；
4. 高精度多道加液器（8道或12道，量程为50-300μl)；
5. 37℃恒温箱；
6. 低温离心机；
7. 纯净水或蒸馏水。

标本收集:
1. 收集血液的试管应为一次性的无热原、无内毒素试管；
2. 血清和血浆避免使用溶血、高血脂标本；
3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除；
4. 标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃冰箱内，避免反复冻融；
5. 可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) ；
6. 收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程；
7. 收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜），因为所有标本都具有一定的潜在危险性；
8. 样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。

标本处理:
1. 血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
2. 血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
3. 组织匀浆：切取组织块，0.01M PBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
4. 细胞培养上清：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
5. 尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃3-6个月）保存；

注意事项:
1．试剂盒使用前请保存在2-8℃。除复溶后的标准品，其他成分不可冻结；
2．浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底；
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，使结晶完全溶解后再配制洗涤液；
4．实验过程中，冻干标准品为一次性使用，不得分装。因其浓度较低，溶解两小时候后，会迅速失活；
5．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用；
6．配制试剂时，要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂，充分混匀对测试结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板1分钟，例如做圆周动作，使加入孔中的反应液混匀；
7．实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作，并在使用前充分预热；
8．ELISA实验中标准品和样本检测时建议作复孔；
9．应将未用的酶标板放回原铝箔袋中，置2-8℃保存；
10．显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；
11．超过使用有效日期的试剂盒不能应用于实验中；
12．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，波长应该设置为450nm和630nm；
13．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为2M硫酸，使用时必须注意安全；
14．各步骤加样均应使用加样器，并经常校准其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样；
15．每次试验测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔最高浓度的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n）；
16．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性；
17．以洗板机洗板时,每孔注液量不应少于350μl, 注意检查加样头是否堵塞。手工洗板时, 用带纸屑的吸水材料应慎重, 防止外源性过氧化物酶类似物或氧化还原物与显色剂发生反应；
18．用终止液终止反应后，请于10分钟内读取OD值；
19．进行复孔实验时，结果计算一定要求平均值；
20．标本溶血可能会有假阳性结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；
21．实验时，应该将加过样品的板条放于密闭盒内，并保持湿度约60%左右；
22．为保证恒温箱内的温度为37℃，恒温箱的温度要经常校准。以确保实验温度保持恒定；

准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温后方可进行试验；
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回 ；
3. 标准品: 加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置10分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，之后在管身标注①，然后根据需要进行稀释注意：务必要保证冻干标准品彻底溶解和混匀。
4. 标准品稀释方法： 取7支洁净的试剂管，分别标注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧. 每管加入300μl标准品稀释液。从第①管内取出300μl加入到第②管，混匀后，再从第②管取出300μl加入到第③管，以此类推至第⑦管。第⑧管为标准品稀释液，作为阴性对照使用。
5. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需用量，用抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)，配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备，仅供当日使用；
6. 酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:100)，配置成酶结合物工作液。使用前30分钟准备，仅供当日使用；
7. TMB显色工作液：在使用之前30分钟，按TMB显色液A x 9份加TMB显色液B x 1份（9：1）的比例配制TMB显色工作液。

洗涤方法:
1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350μl，注入与吸出间隔20－30秒。确保机器运用熟练后，再投入实验中使用；
2. 手工洗板：每孔加洗涤液350μl，静置30秒后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干。手工洗板时，注意加入洗液的过程中，不要造成孔间污染，从而出现跳孔的现象。

操作步骤:
1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于2-8℃；
2. 预留空白孔（若使用双波长读板，空白孔可以不设）；
3. 分别将标本或不同浓度的标准品（0ng/mL孔加标准品稀释液）加入相应孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分钟；
4. 提前30分钟制备生物素化抗体工作液；
5. 洗板2次；
6. 加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，37℃孵箱孵育60分钟；
7. 提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置；
8. 洗板3次；
9. 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分钟；
10. 洗板5次；
11.加入TMB显色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，当标准曲线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过30分钟；
12.加入终止液（包括空白孔）100μl/孔，混匀后即刻测量OD（450nm）值(10分钟内)。

结果判断:
1．每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值（若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴）；
2．手工绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3进行结果计算；
3．若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

操作程序总结:
1.准备试剂，样品和标准品；
2.加入准备好的样品和标准品，37℃反应90分钟 ；
3.洗板2次，加入生物素化抗体工作液，37℃反应60分钟；
4.洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟；
5.洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应；
6.加入TMB终止液；
7.10分钟之内酶标仪测OD值；
4573.计算标本待测因子含量。