人含溴区蛋白4(BRD4) ELISA试剂盒用于定量检测人血清,血浆,细胞培养上清和组织裂解液样品中BRD4的浓度。


检测方法:Sandwich ELISA(Quantitative)

样品类型:Serum, plasma, Cell culture supernatant and tissue samples

反应物种:人

检测目标:BRD4

特异性:
经检测与其它相似物质无明显交叉反应。
该检测可识别重组和天然人BRD4。

样本量:50-100 µl

读数:450 nm

批内差:CV<8%

批间差:CV<10%

回收率:85-110%

别名:CAP; MCAP; HUNK1; HUNKI; FSHRG4; Chromosome-Associated Protein; bromodomain containing 4; Bromodomain Containing Protein 4


检测原理:
人含溴区蛋白4(BRD4) ELISA试剂盒采用双抗体夹心ELISA(Sandwich ELISA)酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)。将抗人BRD4单克隆抗体已预包被在酶标板上，样品和生物素化抗体先后加入酶标板孔反应后，经PBS或TBS洗涤，随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应，经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。


试剂盒组分:
96孔预包被酶标板(8 x 12):1 块;
冻干标准品:2管;
浓缩生物素化抗体:1 x 120 μl;
浓缩酶结合物(ABC):1 x 120 μl;
酶结合物(ABC)稀释液:1 x 12 ml;
抗体稀释液:1 x 12 ml;
标准品稀释液:1 x 15 ml;
样品稀释液:1 x 15 ml;
浓缩洗涤液(25×):1 x 20 ml;
显色剂A:1 x 10 ml;
显色剂B:1 x 1.5 ml;
终止液:1 x 10 ml;


需自备物品:
1. 酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片) ； 2. 洗板机； 3. 移液器（量程为0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl)； 4. 37℃恒温箱； 5. 低温离心机； 6. 纯净水或蒸馏水。


操作步骤:
1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于2-8℃；
2. 预留空白孔（若使用双波长读板，空白孔可以不设）；
3. 分别将标本或不同浓度的标准品（0ng/mL孔加标准品稀释液）加入相应孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分钟；
4. 提前30分钟制备生物素化抗体工作液；
5. 洗板2次；
6. 加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，37℃孵箱孵育60分钟；
7. 提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置；
8. 洗板3次；
9. 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分钟；
10. 洗板5次；
11.加入TMB显色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，当标准曲线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过30分钟；
12.加入终止液（包括空白孔）100μl/孔，混匀后即刻测量OD（450nm）值(10分钟内)。


结果判断:
1．每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值（若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴）；
2．手工绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3进行结果计算；
3．若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 注意事项:
1．试剂盒使用前请保存在2-8℃。除复溶后的标准品，其他成分不可冻结；
2．浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底；
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，使结晶完全溶解后再配制洗涤液；
4．实验过程中，冻干标准品为一次性使用，不得分装。因其浓度较低，溶解两小时候后，会迅速失活；
5．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用；
6．配制试剂时，要用旋涡混合仪混匀。加入孔内的试剂，充分混匀对测试结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板1分钟，例如做圆周动作，使加入孔中的反应液混匀；
7．实验用酶标仪应严格按使用说明书规范操作，并在使用前充分预热；
8．ELISA实验中标准品和样本检测时建议作复孔；
9．应将未用的酶标板放回原铝箔袋中，置2-8℃保存；
10．显色液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下；
11．超过使用有效日期的试剂盒不能应用于实验中；
12．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，波长应该设置为450nm和630nm；
13．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按生物废弃物处理。终止液为2M硫酸，使用时必须注意安全；
14．各步骤加样均应使用加样器，并经常校准其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样；
15．每次试验测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔最高浓度的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n）；
16．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性；
17．以洗板机洗板时,每孔注液量不应少于350μl, 注意检查加样头是否堵塞。手工洗板时, 用带纸屑的吸水材料应慎重, 防止外源性过氧化物酶类似物或氧化还原物与显色剂发生反应；
18．用终止液终止反应后，请于10分钟内读取OD值；
19．进行复孔实验时，结果计算一定要求平均值；
20．标本溶血可能会有假阳性结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；
21．实验时，应该将加过样品的板条放于密闭盒内，并保持湿度约60%左右；
22．为保证恒温箱内的温度为37℃，恒温箱的温度要经常校准。以确保实验温度保持恒定。