对单个细胞或有限的样本进行高度均一的全基因组扩增（WGA）

Features

采用多重置换扩增技术对基因组位点进行无偏差的扩增

适用于二代测序等新技术应用

产量稳定，可达40 µg（产物平均长度大于>10 kb）

可用于癌症、干细胞或宏观基因组学（metagenomics）研究

Product Details

很多研究人员使用二代测序仪器对生物样本的DNA序列进行分析和基因分型，但经常受限于有限的样本量。REPLI-g Single Cell Kit可均一的扩增单个细胞（1至1000个细菌或肿瘤细胞）或纯化的基因组DNA，能够覆盖基因组所有位点。另有专用于干血或新鲜或冷冻的组织样本的实验方案。所有缓冲液和试剂生产都经过严格控制的流程，避免污染DNA，确保每次实验获得可靠的结果。该产品采用多重置换扩增（MDA）技术，对所有基因组位点进行无偏差的扩增。与基于PCR的全基因组扩增技术相比，该技术具有更好的扩增高保真度，避免出现假阳性或假阴性信号。

Performance

覆盖基因组所有位点，十分适用于二代测序和其他下游应用

REPLI-g Single Cell Kit扩增的DNA平均长度大于10 kb，并且覆盖所有基因组位点。该产品已经过验证，适用于二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交（aCGH）和real-time PCR应用等多种下游分析。使用该产品无需单独进行PCR扩增，减少了手动操作，获得的产物长度PCR方法更长。用扩增产物进行二代测序，获得高品质结果。这表明该试剂盒的位点覆盖率大，错配率低，其扩增的DNA（甚至从单一细菌细胞中扩增的DNA）能够与纯化获得的基因组DNA相媲美。另有研究对人类常染色体和X染色体上的多个标记物进行了分析，三个独立的实验均显示：基因组的所有位点被成功扩增，没有遗漏任何一个位点。

表1. 样本类型和研究领域

样本类型（细胞/DNA）          研究领域

人类/动物                                 生物标记物研究（SNP、突变、CNV）

                                                干细胞研究

                                                循环胚胎细胞分析

                                                嵌合体研究

                                                遗传易感性研究

                                                转基因动物基因分型

癌症                                         体细胞遗传变异分析

                                                肿瘤恶化

                                                肿瘤干细胞/进化

                                                循环肿瘤细胞分析

细菌                                         宏观基因组学研究

                                                病原体分析

                                                微生物基因分型

Plants*                                 植物气孔研究

                                                花粉分析

* 没有细胞壁的细胞或纯化的基因组DNA。

REPLI-g Single Cell Kit的表现优于其他供应商的试剂盒

其他供应商的试剂盒基于PCR技术进行全基因组扩增，获得的产物片段较短，带有PCR引物序列，可能影响下游应用。基于PCR的全基因组扩增容易出现错误，会导致碱基对突变、STR的减少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶会导致位点缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能够进行高度均一的全基因组扩增，位点偏差小。对四个试剂盒进行了检测，其中两个利用多重置换扩增技术（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外两个利用PCR技术。采用单一细胞扩增实验方案对所有试剂盒进行序列位点检测。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供应商的试剂盒都出现了位点的遗漏。

Principle

REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase，这是一种优化的新型高保真Phi 29聚合酶。该试剂盒采用多重置换扩增技术扩增复杂的基因组DNA，温和的碱孵育能够避免DNA片段化，促进对所有位点的无偏差扩增。该试剂盒十分适用于分离的肿瘤细胞或细菌细胞等单一细胞，能够扩增获得高产量DNA（参见表1）。此外，该试剂盒还配有专用于鲜血或干血、新鲜或冷冻组织的实验方案，可用于多种研究样本。常规DNA产量可达40 µg，对模板的起始量要求低，因此进行后续遗传分析时无需检测DNA浓度。REPLI-g Single Cell Kit的扩增产物平均长度超过10 kb，且覆盖所有位点，适合于多种应用，包括二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交、焦磷酸测序和real-time PCR分析（参见表2）。

表2. 下游应用和仪器

应用                         仪器

全基因组测序         二代测序平台†

外显子组测序

SNP基因分型芯片 芯片平台†

Array CGH

qPCR/PCR技术       Real-time PCR/PCR仪†

Sanger测序       毛细管测序仪†

焦磷酸测序       PyroMark (QIAGEN)

扩增原理

REPLI-g Single Cell Kit采用等温基因组扩增技术，即多重置换扩增（MDA）。六聚体与变性DNA随机结合，然后在等温条件下，在优化的Phi 29聚合酶作用下，发生链置换合成反应。每个置换后的单链作为模板，与引物结合，可扩增获得高产量DNA。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系中，能够轻松的打开发卡结构等二级结构，因此可促进扩增时聚合酶正常工作。可扩增获得长达100 kb的DNA片段。

细胞裂解和DNA的碱变性 

基因组DNA在用于酶促扩增反应前必须经过变性，而这一变性过程通常使用高温或高pH值（强碱）孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用温和的碱孵育，在细胞裂解、DNA变性的同时，确保DNA片段化程度小，不产生碱基突变。因此扩增获得的DNA完整度高，产物长度长，覆盖位点多。

高效去除可检测到的DNA污染

REPLI-g Single Cell Kit中的所有组分都经过了独特的去污染流程，避免扩增产物被污染。在标准化流程中，对缓冲液和试剂进行紫外线照射，确保其不会污染DNA。紫外线照射后，对试剂盒的所有组分进行严格的质量控制，确保其性能。

Procedure

简单的单管操作

REPLI-g Single Cell Kit可对单一细胞或有限的样本进行简便、可靠、准确的全基因组扩增。反应体系构建十分便利、可靠，仅需15分钟左右的手动操作。专用的缓冲液和试剂可对单一细胞、有限的组织材料、或纯化的DNA进行扩增，产量高、位点覆盖率大（参见表3）。REPLI-g技术扩增获得的DNA可在–20°C长期储存。

表3. REPLI-g Single Cell Kit的成分

试剂盒成分                         优势

REPLI-g sc Polymerase         最长可达70 kb的长片段

                                                保真性是Taq聚合酶的1000倍

                                                覆盖所有位点

                                                均一扩增所有位点

REPLI-g sc Reaction Buffer‡ 对所有位点进行无偏差的扩增

Buffer DLB （裂解和变性） 高效扩增

                                                不损伤DNA

紫外线照射去除污染                 减少可检测到的残留DNA污染

‡ 含有盐、引物和dNTP

Applications

使用REPLI-g Single Cell Kit扩增获得的DNA可用于多种下游应用，包括：

二代测序

采用TaqMan引物/探针对进行的SNP基因分型

基于qPCR和PCR的突变检测

STR/微卫星分析

Sanger测序

焦磷酸测序

aCGH等芯片技术

Supporting data and figures

Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.