从单细胞起始的总RNA或mRNA全转录本扩增

Features

从单一细胞实现完整的转录本覆盖度

MDA技术可实现均一的WTA，序列偏差可以忽略不计

针对新技术应用（包括NGS）优化

总RNA或富集mRNA（ploy A +）RNA的扩增

用于癌症和干细胞研究的新工具

Product Details

REPLI-g WTA Single Cell Kit能够在单细胞转录本水平上对转录调控的影响进行可靠的研究，并允许从单细胞（1–1000个细胞）进行所有转录物的均一扩增。专用的缓冲液和试剂经过了独特的、可控的净化步骤以防止REPLI-g技术扩增污染的核酸。创新的裂解液可以有效地稳定细胞RNA，以确保所得到的RNA准确地反映体内基因的表达图谱。所有的酶促步骤已经过专门改进，使得用于cDNA准确扩增的RNA得到高效处理。而扩增步骤则采用创新的多重置换扩增（MDA）技术，序列偏差可以忽略不计。

Performance

覆盖全转录组，实验可重复性高

REPLI-g WTA Single Cell Kit包含新颖的REPLI-g SensiPhi DNA聚合酶，以及从1–1000个细胞或等量的小量样本进行全转录本扩增（WTA）的优化缓冲液和试剂。高效裂解细胞、彻底清除基因组DNA（gDNA）和敏感的逆转录物之后，采用多重置换扩增（MDA）技术，以可以忽略的序列偏差对整个转录本均一地扩增cDNA。使用REPLI-g WTA Single Cell Kit扩增的cDNA，经证明在二代测序技术（NGS）和real-time PCR应用中具有各细胞间和各次实验间的高度可重复性。扩增的cDNA可以轻松地应用于各种下游应用。

蛋白编码RNA的数量多

扩增富集mRNA的RNA (poly A+)的能力，使REPLI-g WTA Single Cell Kit特别适用于通过NGS研究单细胞转录本水平上的转录调控影响。产生超过90％的NGS片段的核糖体RNA（rRNA）扩增几乎完全被消除，可产生有意义的mRNA-Seq数据。使用mRNA富集实验方法的WTA后，80％以上的读段可以用于定位蛋白编码RNA。

可靠检测低丰度转录本

单细胞分析的挑战性大，尤其是同一细胞内的转录本丰度差异很大时。为获得准确的结果，应确保全转录组扩增时可靠扩增所有转录本。REPLI-g WTA Single Cell Kit高度适合于但细胞中转录本分析，即便是低丰度转录本。对使用REPLI-g技术扩增的转录本abl-1进行real-time PCR分析，结果显示即便是低丰度转录本也能在使用该试剂盒扩增后，得以可靠的检测。

多种研究领域的应用

REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从单细胞（如肿瘤细胞、干细胞或分选细胞）有效地扩增获得cDNA，并从纯化的总RNA或poly A+ RNA（10 pg–100 ng）生成和扩增cDNA，适合于广泛的研究领域（参见下表）。

样本类型和研究领域

样本材料（细胞/总RNA） 研究领域

人类/动物                        生物标记物的研究（表达）

                                       干细胞研究

                                       游离胚胎细胞分析

                                       嵌合体研究

                                       遗传易感性研究

                                       转基因动物基因分型

癌症                               体细胞遗传变异分析

                                      肿瘤恶化

                                      肿瘤干细胞/演化

                                      游离肿瘤细胞分析

Principle

转录调节受到各种因素驱动，如应激、细胞环境或由疾病或体细胞基因组变异（例如，点突变、拷贝数变异或结构变化）等。此外，如可变剪接等转录后加工，导致转录模式不同并最终造成生理机能的不同。由于组织的复合结构，在单细胞中对转录调控进行研究，而不是分析大量的细胞并且立足分析结果解释他们的行为，正不断引起科学家们的兴趣。

REPLI-g WTA Single Cell Kit经过特别设计，能在单细胞转录水平上可靠地研究转录调节的影响。它可以对整个转录本进行高度均一的扩增，并且序列偏差可以忽略不计。REPLI‑g WTA Single Cell Kit提供的单细胞全转录本扩增是对全基因组扩增试剂（REPLI-g Single Cell Kit）的相应补充。本方法基于MDA技术，该技术利用能够复制可达70 kb而无需解离cDNA模板的一种独特的、连续性DNA聚合酶进行cDNA恒温扩增。

REPLI-g WTA Single Cell Kit独特的构成

所有的试剂酶和扩增组分都经过了独特的、可控的净化步骤以确保消除被REPLI-g方法扩增的DNA或RNA污染。下面的步骤则是对试剂进行严格的质量控制，以确保其具有完整的功能。

独特的裂解缓冲液可以有效地稳定细胞RNA和DNA。这确保了所产生的RNA能准确地反映体内基因表达图谱，以及RNA和DNA保持完整无缺，用于随后的基因组覆盖范围最大化分析。

所有的酶促步骤已经过专门改进，使RNA或DNA的扩增准确而有效。例如，这些步骤包括在用于RNA扩增的cDNA合成之前有效的去除gDNA以及确保DNA有效扩增的酶解DNA制备。

新颖的REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase可以用于多重置换扩增（MDA）。它是新开发的高亲和力酶，可以更有效地结合DNA，特别是当DNA浓度在反应混合物中较低时。此外，对比基于PCR的方法，REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase具有较强的校对活性，可以将错误减少1000倍。它还具有很强的链置换活性，通过稳定的发夹结构使DNA得以复制，该结构对以Taq酶为基础的全基因组和全转录扩增步骤具有抗性。

Procedure

基因分析往往需要大量的cDNA。全转录本扩增克服了RNA数量少的限制，可以对小数量的细胞甚至单个细胞进行分析。最简单的反应设置，最简单的反应设置，合理而简单的处理步骤，处理时间只需20分钟，完整的gDNA和RNA平行扩增总反应时间只有4小时，这使得REPLI-g Cell WGA &; WTA Kit的操作步骤变得简单和可靠。 

REPLI-g Cell WGA &; WTA Kit包含用于以下反应的试剂：

细胞裂解：单一细胞样品（含有1-1000个细胞）在5分钟内有效地裂解，对RNA的完整性没有影响。裂解的样品用于总RNA的WTA，或可选的，富集mRNA（poly A+）RNA。

cDNA生产：细胞裂解后，在进行WTA前将gDNA去除，这是由于转录水平的精确测量依赖于消除gDNA污染所造成的假阳性结果。根据随后的逆转录反应过程中所选择的底物，所有的转录物（如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行总RNA富集）或只有多聚腺苷酸转录物（如果采用随机引物和寡核苷酸dT引物进行poly A+ 富集mRNA）将会被扩增。因此，该反应将包含一个随机引物和寡核苷酸dT引物的混合物或只有寡核苷酸dT引物，这就减少了rRNA的扩增，并确保cDNA的3'末端反转录（转录物的大小大约是700–1000bp）。

连接反应：合成的cDNA通过一个高效率的连接反应进行连接。由于该连接反应的性质，cDNA片段并未按照它们原本存在于细胞中的顺序组装。然而，这并不影响核酸序列的检测，如剪接区域，在下游应用中的进行NGS或qPCR。

全转录本扩增：连接的cDNA随后被扩增，利用MDA技术与新颖REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase，等温反应2小时。

根据研究需要，我们针对从单细胞扩增cDNA或纯化RNA提供了不同的实验方案：

“从单细胞扩增mRNA（poly A+）3'端区域”实验方案只扩增带有poly A +尾巴的mRNA（和其他的RNA），适合于广泛的应用，包括NGS(RNA-Seq）、real-time PCR和微阵列分析。

“从单细胞扩增总RNA”实验方案可扩增完整的转录本，包括带有和不带有poly A +尾的RNA，lnc RNA和linc RNA。需要注意的是，rRNA也将扩增并且扩增程度很高。如果用序列特异性探针（例如用qPCR或阵列协同工作），扩增的rRNA并不会影响下游应用的结果。如果将扩增的RNA用于RNA-Seq，请注意超过90％的片段来自于rRNA，因此进行全转录本测序时必须获得充足的读段。

“纯化RNA的扩增”实验方案针对从总RNA或富集RNA模板进行全转录本扩增的情况而优化，非常适合于大规模应用，包括NGS、real-time PCR和微阵列分析。

Applications

REPLI-g WTA Single Cell Kit可以从非常小量的样本均一地扩增全部的转录物，以非常有限或甚至可忽略地偏差扩增，准确呈递单细胞的转录模式。根据实验方法，扩增的cDNA非常适用于二代测序（RNA-Seq）、基因表达芯片或qPCR应用。

REPLI-g WTA Single Cell Kit可用于全转录本扩增的分析：

带poly A+尾巴的mRNA

总RNA

RNA转录组的所有区域

mRNA的3'末端

Lnc和Linc RNA

其不适合用于与小量核酸等一起使用：

tRNA和miRNA

Supporting data and figures

High number of mappable reads from just 3 cells.

REPLI-g WTA Single Cell reactions were performed on 3–1000 cells in various replicates, using the mRNA (poly A+) enrichment protocol to reduce rRNA amplification. WTA amplified cDNA was fragmented (Covaris S220) and an NGS sequencing library was prepared using the GeneRead Library Prep I Kit (QIAGEN). Sequencing was done on a MiSeq Instrument (Illumina) and RNA biotypes were mapped using Bowtie2. Results demonstrate that the majority of reads (>80%) are mappable to protein coding RNA and Linc RNAs, and that a negligible number of reads map to other, non-targeted RNA biotypes (data for minor RNA biotypes not shown). Comparable results between values obtained after the sequencing of all WTA samples (Mean value [all cells]) and 3-cell WTA samples (Mean value [3 cells]) were obtained.